低濃度臭氧控制紅蘋果李斯特菌的有效性研究

        本研究旨在探討低劑量連續(xù)臭氧氣體對紅冠蘋果長期商業(yè)冷藏過程中無害李斯特菌和品質(zhì)屬性及病害的控制效果。Red Delicious 蘋果以 ～6.2 log 10 CFU/蘋果接種三株無害乳桿菌混合物，用或不用 1-甲基環(huán)丙烯處理，然后在商業(yè)環(huán)境中用或不用連續(xù)氣態(tài)臭氧進(jìn)行受控氣氛 (CA) 儲(chǔ)存設(shè)施 36 周。將經(jīng)受上述儲(chǔ)存條件的未接種紅美味蘋果用于酵母/霉菌計(jì)數(shù)和質(zhì)量屬性評估。36 周的冷凍空氣 (RA) 或 CA 儲(chǔ)存導(dǎo)致約 2.2 log 10 CFU/蘋果減少無害乳桿菌。與單獨(dú)的 RA 和 CA 存儲(chǔ)相比，臭氧氣體的應(yīng)用導(dǎo)致無害乳桿菌的額外 > 3 log 10 CFU/蘋果減少。在 36 周的 CA 儲(chǔ)存過程中，連續(xù)施用低劑量的氣態(tài)臭氧顯著延緩了酵母/霉菌的生長，延緩了蘋果的硬度損失，并且對臭氧燃燒、皮孔腐爛、赤褐色、CO 2損傷、表面燙傷、與單獨(dú) CA 存儲(chǔ)相比，Red Delicious 蘋果的軟燙?？傊B續(xù)應(yīng)用低劑量氣態(tài)臭氧有可能控制紅美味蘋果上的李斯特菌，而不會(huì)對蘋果的品質(zhì)屬性產(chǎn)生負(fù)面影響。

介紹

        單核細(xì)胞增生李斯特菌可在易感人群中引起致命的李斯特菌病，并且死亡率很高（CDC，2017）。單核細(xì)胞增生李斯特菌廣泛存在于農(nóng)業(yè)環(huán)境中。美國食品和藥物管理局對蘋果和其他即食食品實(shí)施零容忍（Shank 等人，1996 年；FDA，2008 年）。蘋果在開放環(huán)境中生長，因此在生產(chǎn)或隨后的采后包裝過程中可能受到單核細(xì)胞增生李斯特菌的感染（ Angelo 等人，2017 年）。單核細(xì)胞增生李斯特菌與兩次多州焦糖蘋果暴發(fā)有關(guān)（Angelo 等人，2017 年；Marus 等人，2019 年）) 以及多個(gè)新鮮蘋果品種 ( FDA, 2017 , 2019 ) 和鮮切蘋果 ( FDA, 2016 , 2020b ) 的多次召回。這些暴發(fā)和召回凸顯了蘋果李斯特菌污染的風(fēng)險(xiǎn)以及控制蘋果李斯特菌的重要性。收獲后，蘋果通常在受控氣氛 (CA) 冷藏庫中冷藏長達(dá) 12 個(gè)月。在這種長期儲(chǔ)存過程中進(jìn)行抗菌干預(yù)可以為控制新鮮蘋果上的李斯特菌提供潛在的干預(yù)策略（ Sheng 和 Zhu，2021 年）。

        臭氧是一種強(qiáng)氧化劑和強(qiáng)效抗菌劑，不會(huì)在處理過的產(chǎn)品上留下任何殘留物（Guzel-Seydim 等人，2004 年）。臭氧氣體被食品和藥物管理局批準(zhǔn)為公認(rèn)安全劑（FDA，2020a），并被批準(zhǔn)用于有機(jī)生產(chǎn)和處理（USDA-NOP，2021）。已經(jīng)研究了以固定速率在短時(shí)間內(nèi)控制主要食源性病原體的氣態(tài)臭氧，包括大腸桿菌O157:H7（Han 等人，2002 年）、沙門氏菌（Das 等人，2006 年）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Alwi 和 Ali，2014 年；Concha-Meyer 等人，2014 年) 新鮮農(nóng)產(chǎn)品。例如，10 mg/L 的臭氧氣體可在1 小時(shí)內(nèi)使番茄上接種的腸炎沙門氏菌減少約 7 log 10 CFU/番茄（Das等人，2006 年）。在 4°C 下儲(chǔ)存 10 天后，新鮮藍(lán)莓上的 4 mg/L 氣態(tài)臭氧可將單核細(xì)胞增生李斯特菌減少 3 log 10 CFU/ml（ Concha-Meyer 等人，2014 年）。20 分鐘的氣態(tài)臭氧 (23 mg/L) 暴露導(dǎo)致帝國蘋果上單核細(xì)胞增生李斯特菌的 2.1–3.1 log 10 CFU/蘋果減少（Murray 等人，2018 年）。還研究了臭氧氣體以控制不同蘋果品種在儲(chǔ)存期間的常駐微生物群（Yaseen 等，2015）。在 1°C 儲(chǔ)存條件下，暴露 0.5 mg/L 的臭氧氣體 60 天會(huì)導(dǎo)致新鮮蘋果上的擴(kuò)展青霉減少 2.7-4.0 log ，具體取決于品種（Yaseen 等人，2015 年）。

       此外，在儲(chǔ)存期間使用臭氧氣體有利于保持水果品質(zhì)。例如，據(jù)報(bào)道，1-3 毫克/升的臭氧暴露可保持蘋果的硬度（Antos 等人，2018 年）并減少蘋果的重量損失（Juhnevica-Radenkova 等人，2019 年）。我們之前表明，在 CA 儲(chǔ)存中連續(xù)應(yīng)用 30 周 87 μg/L 的氣態(tài)臭氧可將富士蘋果上李斯特菌減少 5.0 log 10 CFU/蘋果，而不會(huì)對蘋果果實(shí)質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。盛等人，2018）。然而，這種影響不能直接轉(zhuǎn)移到其他蘋果品種，因?yàn)槊總€(gè)蘋果品種都有其獨(dú)特的表皮蠟和常駐微生物群組成，這些成分會(huì)影響李斯特菌的持久性和對抗菌干預(yù)的反應(yīng)（Chai 等人，2020 年；Ku 等人，2020 年；Abdelfattah 等人）等，在新聞中）。

        Red Delicious 蘋果是美國很暢銷的蘋果品種之一（USAA，2019 年），很近因潛在的單核細(xì)胞增生李斯特菌污染而被召回（FDA，2019 年）。與其他商業(yè)化種植的蘋果品種相比，Red Delicious 蘋果特別容易出現(xiàn)水核，在長期 CA 儲(chǔ)存期間發(fā)生內(nèi)部疾?。ɡ鐑?nèi)部褐變）的風(fēng)險(xiǎn)增加（Mattheis，2008 年），進(jìn)一步導(dǎo)致蘋果產(chǎn)業(yè)遭受損失。本研究的目的是研究不同商業(yè)儲(chǔ)存方式與不同劑量的連續(xù)氣態(tài)臭氧在控制無害李斯特菌方面的效果，在有或沒有 1-甲基環(huán)丙烯 (1-MCP) 預(yù)處理的 Red Delicious 蘋果上與L. monocytogenes ( Buchrieser et al., 2003 ) 在系統(tǒng)發(fā)育上相關(guān)。進(jìn)一步評價(jià)了紅冠蘋果在不同貯藏條件下品質(zhì)屬性的維持情況。

材料和方法

無害李斯特菌培養(yǎng)準(zhǔn)備

        兩種L. innocua 食品分離物，NRRL 33314 和 NRRL 33554，以及一種加工廠分離物L(fēng). innocua，NRRL 33197，來自 USDA-ARS 培養(yǎng)物保藏中心 [National Center for Agriculture Utilization Research (NRRL), Peoria, IL, United州] 并儲(chǔ)存在添加 0.6% 酵母提取物 (TSBYE；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, United States) (TSBYE) 和 20 -80°C 下的 % (v/v) 甘油。每個(gè)冷凍培養(yǎng)物在 TSBYE 中在 37°C 下連續(xù)轉(zhuǎn)移兩次 24 小時(shí)。通過組合等量的單個(gè)L. innocua菌株來制備三菌株雞尾酒接種物。個(gè)體L. innocua通過在 TSAYE（含 1.5% 瓊脂的 TSBYE）板上連續(xù)稀釋和鋪板來計(jì)數(shù)菌株或三菌株混合物。

蘋果接種

        新鮮未上蠟的紅美味蘋果，在商業(yè)成熟時(shí)手動(dòng)收獲，康奈爾淀粉指數(shù)顯示范圍為 2.8-3.5（Blanpied 和 Silsby，1992 年），儲(chǔ)存在商業(yè)儲(chǔ)藏室（亞基馬，華盛頓州，美國），溫度為 ～ 1°C 并在研究前送到實(shí)驗(yàn)室。本研究選擇了沒有割傷、瘀傷或疤痕的蘋果（~200 克）。對于L. innocua接種，將蘋果浸入在無菌磷酸鹽緩沖鹽水（1 × PBS，pH 7.4）中稀釋的三株L. innocua接種物中，以獲得約 6.2 log 10的接種水平CFU/蘋果。接種后的蘋果在室溫（~22°C）下放置 24 小時(shí)，然后進(jìn)行相應(yīng)的儲(chǔ)存。分別在 0 和 24 小時(shí)隨機(jī)抽取 40 個(gè)接種蘋果，以確認(rèn)初始細(xì)菌水平和接種的均勻性。

蘋果的貯藏處理

        接種后 24 小時(shí)的蘋果被隨機(jī)裝入塑料箱中；每箱 40 個(gè)蘋果。將盒裝接種過的蘋果隨機(jī)分成6組，其中一半在貯藏前用1.0 mg/L 1-MCP氣態(tài)空氣處理24 h。然后將蘋果置于冷凍空氣 (RA; 0.2 ± 0.1°C) 和 CA (0.2 ± 0.1°C, 3.1 ± 0.0% O 2 , 0.4 ± 0.0% CO 2 ) 中，有或沒有 60.2 ± 5.7 或78.7 ± 13.2 μg/L 在半商業(yè) RA/CA 房間（3,200 ft 2）在商業(yè)設(shè)施（Stemilt Growers LLC，Wenatchee，WA，United States）中的相對濕度約為 90%。臭氧氣體由商用臭氧發(fā)生器產(chǎn)生，并通過比例-積分-導(dǎo)數(shù)算法自動(dòng)轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)存室，以在儲(chǔ)存期間將臭氧劑量保持在目標(biāo)水平。臭氧濃度在儲(chǔ)存的第一周開始，在第四周開始時(shí)達(dá)到目標(biāo)濃度。同時(shí)，分離的未接種蘋果組被包括在上述儲(chǔ)存條件中，用于居民微生物區(qū)系計(jì)數(shù)和蘋果品質(zhì)評價(jià)。

        接種后的蘋果在儲(chǔ)存 3、6、12、18、24、30 和 36 周后取樣，用于L. innocua計(jì)數(shù)。在儲(chǔ)存 6、12、24 和 36 周后對未接種的蘋果進(jìn)行取樣，以測定總平板計(jì)數(shù) (TPC) 和酵母/霉菌計(jì)數(shù)。蘋果質(zhì)量屬性在收獲時(shí)和儲(chǔ)存 6 個(gè)月和 9 個(gè)月時(shí)進(jìn)行評估。每個(gè)貯藏條件下每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣 40 個(gè)蘋果用于微生物計(jì)數(shù)、質(zhì)量屬性和內(nèi)部紊亂評價(jià)，而每個(gè)貯藏條件下每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣 100 個(gè)蘋果用于外部紊亂評價(jià)，其中每個(gè)蘋果被視為一個(gè)實(shí)驗(yàn)單元。

無害李斯特菌枚舉

將每個(gè)蘋果轉(zhuǎn)移到裝有 10 ml 無菌 1 × PBS 的胃袋（Fisher Scientific）中，并用手揉搓 80 秒。摩擦溶液用無菌 1 × PBS 連續(xù)稀釋 10 倍，鋪在 TSAYE 板上，然后覆蓋改性牛津瓊脂 (MOX) (BD) 以區(qū)分李斯特菌和背景細(xì)菌（Shen 等人，2019 年），并在37°C 48 小時(shí)。L. innocua在 MOX 瓊脂平板上產(chǎn)生典型的黑色菌落，周圍有黑色暈圈。對于低于檢測限（10 CFU/蘋果）的樣品，將 1.0 ml 摩擦溶液在緩沖的李斯特菌富集緩沖液 (BLEB) (BD) 中在 30°C 下富集 48 小時(shí)；李斯特菌的存在/不存在已經(jīng)報(bào)道。將富集培養(yǎng)物分別劃線到 MOX 和 CHROMagar TM 李斯特菌（CHROMagar，Paris，F(xiàn)rance）平板上，以定性檢測李斯特菌的存在（Sheng 等人，2017 年）。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)存儲(chǔ)方案的樣本大小為每次復(fù)制 10 個(gè)蘋果，每個(gè)存儲(chǔ)方案有四個(gè)獨(dú)立的復(fù)制。

居民微生物群計(jì)數(shù)

未接種蘋果的處理方式與接種蘋果相同。將適當(dāng)稀釋度的摩擦溶液分別鋪在重復(fù)的 TSAYE 板和馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA; BD) 板上，用于 TPC 和酵母/霉菌計(jì)數(shù)。TSAYE 板在 37°C 下孵育 24 小時(shí)，而 PDA 板在室溫 (22°C) 下孵育 5 天。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)存儲(chǔ)方案的樣本大小為每次復(fù)制 10 個(gè)蘋果，每個(gè)存儲(chǔ)方案有四個(gè)獨(dú)立的復(fù)制。

水果品質(zhì)分析

根據(jù)已發(fā)表的方法，在收獲時(shí)以及冷藏后 6 個(gè)月和 9 個(gè)月時(shí)對未接種蘋果的果實(shí)質(zhì)量屬性（包括硬度、總可溶性固形物 (TSS) 和可滴定酸度 (TA) 進(jìn)行了評估（Sheng 等人，2018 年）。簡而言之，使用水果質(zhì)地分析儀（FTA GS-15-643，Güss Manufacturing，Ltd.，Strand，南非）在去皮區(qū)域（~3 cm 2) 在每個(gè)蘋果的陽光照射和陰影面。TSS 含量使用 Atago PR-32 數(shù)字糖度折光儀（Atago Co., Ltd., Tokyo, Japan）測量。果汁的 TA 表示為蘋果酸含量的百分比（每 100 克蘋果鮮重的蘋果酸克數(shù)），并使用電位滴定儀（Titrando 888 和 875 Robotic USB Sample Processor XL, Metrohm, Riverview, FL, United狀態(tài)）。蘋果質(zhì)量分析使用了每次重復(fù) 10 個(gè)蘋果的樣本量，每個(gè)存儲(chǔ)方案有四個(gè)獨(dú)立的重復(fù)。

水果障礙分析

在收獲時(shí)和冷藏 6 個(gè)月和 9 個(gè)月后檢查水果是否有外部疾病。外部疾病包括臭氧燒傷（蘋果暴露側(cè)的表面凹坑）、表面燙傷（皮膚上的棕色斑塊和變色）、皮孔腐爛（皮孔周圍的深棕色凹坑）、腐爛（可見的菌絲體或孢子團(tuán)）、赤褐色（在皮膚）和 CO 2損傷（皮膚上的雪花樣斑塊）按照先前描述的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行目視檢查（Sheng 等人，2018 年）。軟燙傷，特征是蘋果表面有光滑或不規(guī)則形狀的棕色損傷（DeEll，2013)，也進(jìn)行了評估。蘋果被切片 3 次，用于評估內(nèi)部疾病，包括水核和內(nèi)部褐變。Watercore 的特點(diǎn)是富含山梨糖醇的液體在與脈管系統(tǒng)相鄰的肉的細(xì)胞間隙中積聚（Marlow 和 Loescher，1984 年）。內(nèi)部褐變的特征是通常起源于核心區(qū)域附近的果肉變褐色（Argenta 等，2001）。結(jié)果報(bào)告為每個(gè)貯藏期內(nèi)單獨(dú)處理中的蘋果與各自的無序/總蘋果 (%)。內(nèi)部紊亂評估使用每個(gè)重復(fù) 10 個(gè)蘋果的樣本大小，每個(gè)儲(chǔ)存方案有四個(gè)獨(dú)立重復(fù)。對于外部紊亂評估，每個(gè)存儲(chǔ)方案使用 100 個(gè)蘋果的樣本大小。在室溫 (22°C) 下 1 天和 7 天后對蘋果進(jìn)行評估。

統(tǒng)計(jì)分析

使用 IBM SPSS 19.0 (Chicago, IL, United States) 分析數(shù)據(jù)。通過單向方差分析 (ANOVA) 識別平均差異，然后進(jìn)行 Tukey 多重比較測試。p < 0.05 的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖所示。紅鮮蘋果商業(yè)冷藏36周內(nèi)無毒蜱的存活研究。a - cMean在沒有公共字母的各采樣點(diǎn)上差異顯著(p < 0.05)。平均值±SEM, n = 32-40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲(chǔ)存，氣體O3持續(xù)施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲(chǔ)存時(shí)連續(xù)施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲(chǔ)存時(shí)連續(xù)施加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏前用1-MCP處理。

圖在商業(yè)冷藏的36周內(nèi)，紅美味蘋果上的駐留細(xì)菌。a,b不帶公共字母的各采樣點(diǎn)均值差異顯著(p < 0.05)。均值±SEM, n = 40。MCP，蘋果在冷藏前用1-MCP處理;CAHighO3, CA儲(chǔ)存，氣體O3持續(xù)施加在78.7±13.2 μg/L;CAMCPHighO3, CA儲(chǔ)存時(shí)連續(xù)施加氣體O3(78.7±13.2 μg/L)，冷藏前用1-MCP處理蘋果;CAMCPLowO3, CA儲(chǔ)存時(shí)連續(xù)施加氣體O3(60.2±5.7 μg/L)，蘋果在冷藏前用1-MCP處理。

結(jié)論

經(jīng)過 9 個(gè)月的商業(yè) RA 或 CA 儲(chǔ)存，Red Delicious 蘋果上的無害乳桿菌計(jì)數(shù)減少了 ~2 log CFU/蘋果。在60.2–78.7 μg/L 的連續(xù)低劑量臭氧氣體處理下，無害乳桿菌的減少量增加了 1,000 倍；> 5.0 log 10 CFU/蘋果在儲(chǔ)存 24 周后減少。此外，與無臭氧氣體的 CA 儲(chǔ)存相比，在 CA 儲(chǔ)存中應(yīng)用低劑量氣態(tài)臭氧可延緩常駐微生物群的生長，延緩蘋果硬度損失，改善蘋果品質(zhì)，并且對 Red Delicious 蘋果的外部疾病沒有負(fù)面影響。因此，低劑量的連續(xù)氣態(tài)臭氧應(yīng)用是蘋果行業(yè)控制李斯特菌的一個(gè)有前景的策略。和 Red Delicious 蘋果上的微生物腐爛。需要進(jìn)一步研究不同臭氧用量和蘋果品種，以確保新鮮蘋果的安全和質(zhì)量。