臭氧對營養(yǎng)菌和孢子菌的滅活作用研究

不同類型微生物的氣態(tài)臭氧滅活是成功地實現(xiàn)的，眾所周知，只要氣相被強烈加濕。然而，這一過程中涉及的失活機制和物種尚未明確確定。為了深入了解，我們考慮將細(xì)菌孢子暴露在干燥而不是潮濕的臭氧中，這是一種不太復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境。與大多數(shù)已發(fā)表的文獻(xiàn)相反，研究表明，在嚴(yán)格的干燥臭氧條件下，細(xì)菌孢子可以滅活，但滅活程度在很大程度上取決于孢子類型和底物材料。在這種情況下，由于沒有檢測到孢子的外部侵蝕，因此確定O3分子通過其擴散到孢子內(nèi)并在孢子內(nèi)氧化作用來負(fù)責(zé)失活過程。

使用加濕臭氧，觀察到較高的失活效率，這很可能部分與孢子的膨脹ling有關(guān)，這有助于氧化物質(zhì)在其內(nèi)部擴散并一直擴散到核心;除O3外，這些氧化劑源于O3與H2O的相互作用，很終導(dǎo)致孢子結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，而與干臭氧暴露相比，孢子完整性得以保持。

以往工作回顧

從一開始以及此后相當(dāng)長的一段時間內(nèi)，在環(huán)境空氣中使用臭氧作為氣態(tài)殺菌劑的濃度水平被限制在接近1ppm的水平(事實上，就人體毒性而言，0.1 ppm被確定為占用(每周40小時)很大安全值)。

Elford和Van de Eude(1942)在已知溫度和相對濕度(RH)值的房間中對氣溶膠化細(xì)菌懸浮液進(jìn)行了研究，他們確定在60-80% RH的房間中，臭氧濃度超過1ppm是相對于干燥環(huán)境的更好條件。

Kowalski等人(1998)研究了空氣中高濃度臭氧對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌營養(yǎng)細(xì)菌的影響。

將微生物暴露于空氣中濃度為300至1500 ppm、相對濕度為18-20%的臭氧中10至480秒:在1500 ppm和8分鐘內(nèi)，兩種微生物的死亡率均超過99.99% (>4 log)。

依靠干氣體臭氧，但濃度要高得多，Held研究了醫(yī)院廢物的凈化(Held, 2002;Coronel等人，2002年)，由革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的營養(yǎng)細(xì)菌、真菌、分枝桿菌和孢子細(xì)菌(如萎縮芽孢桿菌、嗜脂嗜熱地桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌)組成。測試了從干空氣電暈放電中獲得的臭氧濃度為10,000-12,000 ppm。

該系統(tǒng)允許超過107個營養(yǎng)細(xì)菌/mL的失活(金黃色葡萄球菌，萎縮桿菌，大腸桿菌…)

暴露1小時內(nèi)，處理2小時后孢子數(shù)超過107個/mL。

Ishizaki等人(1986)研究了臭氧濃度在250至1500 ppm(0.5至3 mg/L)范圍內(nèi)的氣態(tài)臭氧對不同芽孢桿菌孢子的殺孢活性，并著重研究了相對濕度水平的影響。

在50%或更低的相對濕度下，暴露6小時后，存活的數(shù)量沒有明顯減少。

然而，在較高的RH值下，在不到2小時的時間內(nèi)達(dá)到了5對數(shù)的降低，這一點后來被Currier等人(2001)證實。

Aydogan和Gurol(2006)的結(jié)果還表明，在70-95%相對濕度的條件下，將O3濃度從1 mg/L增加到3 mg/L，可以提高孢子的失活率，但超過3 mg/L (1500 ppm)時，只觀察到微弱的額外增加。

從前面的作品中可以看出三點:

(i)臭氧濃度越高，相對濕度越高(0.50%)，滅活過程越有效。

事實上，在某些情況下，濕度是絕對需要的，以達(dá)到無菌，如TSO3的情況

TM滅菌系統(tǒng)，由加拿大衛(wèi)生部和FDA(美國食品藥品管理局)批準(zhǔn);

(ii)加濕的氣態(tài)臭氧相對于干的氣態(tài)臭氧作為殺生劑的附加值肯定是在干臭氧條件下幾乎沒有工作的部分原因(Ishizaki et al.， 1986);

(iii)然而，根據(jù)文獻(xiàn)尚未嚴(yán)格確定臭氧過程中涉及的失活機制和物種。

臭氧暴露下可能的失活機制綜述

強氧化劑通常能夠化學(xué)攻擊微生物的成分，即蛋白質(zhì)、不飽和脂質(zhì)、革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖層、細(xì)胞內(nèi)酶(如呼吸酶)和核酸(遺傳物質(zhì))，以及孢子外殼和病毒衣殼中的蛋白質(zhì)和肽聚糖(Tseng和Li, 2008)。

營養(yǎng)細(xì)菌

臭氧使?fàn)I養(yǎng)細(xì)菌失活是一個復(fù)雜的過程，因為臭氧會破壞營養(yǎng)細(xì)菌的大量成分;然而，O3被認(rèn)為主要引起細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化。這些結(jié)構(gòu)的逐漸降解涉及到滲透性和細(xì)胞完整性的改變，并且通常伴隨著細(xì)胞裂解(Broadwater et al.， 1973;Kim and Yousef, 2000;Khadre and Yousef, 2001;Thanomsub et al.， 2002)。

沿著這條線，Kim和Youssef(2000)觀察到革蘭氏陰性菌(大腸桿菌…)的損害更為明顯?？赡苁且驗樗鼈兊闹嗵菍颖雀锾m氏陽性菌(金黃色葡萄球菌…)(Komanapali and Lau, 1998;Komanapali and Lau, 1996)。Hunt和Marinas(1999)基于透射電子顯微鏡(TEM)顯微照片對細(xì)菌失活提出了不同的解釋:他們觀察到臭氧處理后大腸桿菌的類核收縮。這些作者得出結(jié)論，O3能夠穿透細(xì)胞，并與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或許多酶發(fā)生反應(yīng)，這些酶參與控制DNA con的形成，從而導(dǎo)致其錯誤折疊。

細(xì)菌孢子

研究細(xì)菌孢子的主要興趣在于它們是耐藥的微生物，正因為如此，官方要求驗證滅菌過程。細(xì)菌孢子可以經(jīng)受嚴(yán)酷的處理，包括熱、輻照、化學(xué)藥品和干燥。芽孢桿菌種類的細(xì)菌孢子已被證明對臭氧特別敏感 (Kowalski et al.， 1998)，因此被用于本研究。人們先驗地認(rèn)為，細(xì)菌材料孢子受臭氧的影響比營養(yǎng)細(xì)菌小，因為它們具有多層保護(hù)和抗逆性。文獻(xiàn)中已經(jīng)提出了誘導(dǎo)孢子致死的各種O3靶點，下面我們將詳細(xì)介紹。

酶

一些作者認(rèn)為酶損傷是O3殺死細(xì)胞的重要失活機制(Hinze et al.， 1987;Takamoto et al.， 1992)。Young和Setlow(2004)表明，與野生型孢子相比，缺乏某種酶(第二皮層裂解酶(SleB))的萎縮芽孢桿菌突變孢子被O3滅活的速度更快(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。此外，Takamoto等人(1992)觀察到，臭氧在不同程度上降低了大腸桿菌中酶的活性，這取決于所考慮的酶的具體性質(zhì)。

DNA。它也可能是一個靶標(biāo)，因為O3與核堿基反應(yīng)迅速，尤其是胸腺嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶(Ishizaki et al .， 1986;Swadeshi et al.， 1986)。相反，像Young和Setlow(2004)這樣的作者聲稱水中的臭氧不會通過DNA損傷殺死孢子。在這里，水中的O3在100% RH的環(huán)境中被同化為臭氧。孢子的外套。孢子被毛是指，從孢子很外層開始，表層，然后是外被毛和內(nèi)被毛。再往里看，有皮層，內(nèi)膜和包含DNA的核心。孢子外殼約占孢子體積的50%，包含約80%的孢子蛋白質(zhì)，因此構(gòu)成代謝功能損傷的屏障(例如酶)。

孢子對殺菌劑產(chǎn)生抗性的主要因素似乎是孢子的外殼(Komanapali和Lau, 1996;Young and Setlow, 2004)。Kim等人(2003)的TEM顯微照片也支持了這一觀點，在水氧化處理的情況下，TEM顯微照片顯示了對表層以及外層和內(nèi)層的損害。這種損傷為O3在皮層上的作用開辟了道路，很終通過細(xì)胞內(nèi)損傷導(dǎo)致孢子失活(Kim et al.， 2003;Young and Setlow, 2004)。

此外，F(xiàn)oegeding(1985)發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌的外殼蛋白被去除后，在水溶液中比完整的孢子更快地失活:他們得出結(jié)論，孢子的外殼是對抗O3分子的主要保護(hù)屏障。更廣泛地說，化學(xué)脫去的孢子和外殼有缺陷的孢子(結(jié)果來自主要外殼形成蛋白cotE的突變)被水溶液O3殺死的速度要比外殼完整的孢子快得多(Young和Setlow, 2004)。這使得Young和Setlow(2004)得出結(jié)論，孢子外殼(特別是在萎縮芽孢桿菌孢子中)在孢子對O3的抗性中是必不可少的。膜也會被氧化劑破壞，包括O3 (Cortezzo et al.， 2004)。很近的研究結(jié)果表明，孢子內(nèi)膜可能是O3致死性損傷的部位，因為受損的內(nèi)膜:

(i)阻止孢子在正常模式高溫?zé)崽幚砘蚱涿劝l(fā)形式面臨滲透脅迫時保持完整性;

(ii)因為它變得更具有滲透性。Cortezzo等人(2004)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氧化劑對孢子內(nèi)膜的破壞也與觀察到的甲胺更快地滲透到處理過的孢子核心一致:內(nèi)膜可能是甲胺進(jìn)入孢子核心的關(guān)鍵滲透性屏障。這一滲透性屏障的破裂可能導(dǎo)致孢子核心內(nèi)容物的釋放(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。

為了深入了解臭氧暴露后微生物的失活機制，我們首先使用干燥的氣態(tài)臭氧，這是一個比潮濕的氣態(tài)臭氧更不復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境:

在氣態(tài)臭氧中加入水蒸氣會帶來額外的氧化劑，使確定它們的相對貢獻(xiàn)和確定失活機制變得更加困難。本文通過存活曲線研究了細(xì)菌孢子在嚴(yán)格干燥臭氧條件下的inac活化動力學(xué)，并利用掃描電鏡 (SEM)檢查了相應(yīng)的損傷。還介紹了暴露于加濕臭氧的孢子的這種特征數(shù)據(jù)。利用文獻(xiàn)資料，對這兩組實驗結(jié)果(干臭氧和濕臭氧情況)進(jìn)行密切的“不同”分析，使我們能夠提出一幅新的更詳細(xì)的圖片，說明細(xì)菌孢子在臭氧作用下的失活機制。

材料與方法

由于臭氧具有很強的氧化能力，它能或多或少地破壞各種材料。為了盡量減少這種可能的影響，這可能會干擾我們的實驗，滅菌室由316不銹鋼制成(要求承受加濕臭氧)，用于光譜觀察的窗戶由熔融二氧化硅制成。待調(diào)查的微生物沉積在由聚苯乙烯(干臭氧暴露)或耐熱玻璃(濕臭氧暴露)制成的培養(yǎng)皿上。

臭氧化系統(tǒng)

圖1顯示了用于產(chǎn)生臭氧并在臭氧進(jìn)入和離開腔室時測定其濃度的系統(tǒng)的各種元件。

該腔室由316不銹鋼制成，是一個400毫米長，100毫米高，220毫米寬的平行六面體(6升體積)。

臭氧濃度可以用基于紫外線吸收的分析儀來監(jiān)測。

生成的廢水也可以通過FTIR光譜進(jìn)行分析:來自Thermo Nicolet的Avatar 370光譜儀使用DTGS (7800-375 cm-1)探測器，掃描次數(shù)和分辨率分別設(shè)置為80和1 cm-1。

臭氧發(fā)生器在氣相中提供分子氧和原子氧的混合物;

它在電流范圍內(nèi)工作，在電流范圍內(nèi)增加臭氧濃度。

臭氧流是干燥的，因為發(fā)生器是由(高純度)O2干氣瓶提供的。

本文所用的“干臭氧”一詞是指相對濕度(RH)小于約2%(用濕度計測定)的氣態(tài)臭氧。

總氣體流量設(shè)定為5.64標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘(slm)，在干燥條件下實現(xiàn)臭氧濃度為4,000 ppm。

在工藝線的末端安裝了一個臭氧破壞者，用于減少臭氧并將其作為O2釋放，以符合安全(毒性)法規(guī)。

出于安全考慮，該腔室也位于通風(fēng)柜內(nèi)，并連接了真空干泵，以確保在過程結(jié)束時腔室流出物被完全排出。

在使用加濕臭氧的過程中可以加入水蒸氣。

水通過蠕動泵送到“烤箱”(加熱器)，產(chǎn)生的蒸汽被進(jìn)入的O2氣流驅(qū)動到O3管線。

在給定的加熱器溫度和給定的O2流量下，注入的水蒸氣量取決于蠕動泵設(shè)定的H2O流量。

在單獨存在O2的情況下，用濕度計(Kahn, Wethersfield, CT, USA)測定腔內(nèi)相應(yīng)的RH水平(RH可精確測量至少95%(0.3%))。

在加濕條件下，總氣體流量設(shè)置為2.6 slm，以實現(xiàn)約4 000 ppm的臭氧濃度。

腔內(nèi)氣體溫度保持接近環(huán)境溫度(≈22℃)。

總結(jié)與結(jié)語

了解暴露于加濕氣體臭氧導(dǎo)致的微生物失活機制是一項復(fù)雜而艱巨的任務(wù)。我們的方法是，在嚴(yán)格的干燥氣體臭氧暴露(RH, 2%)下，檢查三種生物指示孢子和一種細(xì)菌的失活動力學(xué)和形態(tài)損傷，然后考慮濕化氣體臭氧暴露的情況:很后，將這兩項研究的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，有助于揭示各種失活機制。

在干燥的氣態(tài)臭氧暴露下，我們已經(jīng)證明O3分子可以有效地滅活某些類型的孢子(G. stearothermophilus)，而其他類型的孢子(B. atrophaeus)則更少，滅活率的差異可能在于其成分的性質(zhì)或排列，本質(zhì)上是其外殼(和內(nèi)膜)的化學(xué)成分。孢子的形態(tài)不受干臭氧處理的影響，這意味著擴散/氧化，而不是侵蝕，與O3分子的作用有關(guān)，這些分子在孢子內(nèi)移動。

此外，我們還表明，沉積在不同聚合物基質(zhì)上的孢子的臭氧滅活效果取決于聚合物的性質(zhì)。

在加濕的氣態(tài)臭氧暴露下，我們認(rèn)為一個重要的初始機制(在殺生物作用之前)是孢子的水膨脹，這打開了“通道”，促進(jìn)了殺生物劑的內(nèi)部擴散。

這些是O3分子及其與H2O相互作用的副產(chǎn)物，產(chǎn)生高度氧化的物質(zhì)，如HO.2, OH。過氧化氫。這些氧化過程的很終結(jié)果是在一定程度上抵抗干臭氧作用的孢子(b.s atrophaeus)失活，在足夠長的暴露時間后，這里使用的所有三種生物指示劑都被嚴(yán)重破壞，甚至粉碎。O3分子和氧化自由基對濕化臭氧失活過程的相對貢獻(xiàn)可以在未來的工作中確定。下一步可能是呼吁分子生物學(xué)來評估孢子核酸所遭受的損害的種類和程度。

正在進(jìn)行涉及臭氧和表面凈化的進(jìn)一步工作。它涉及的事實是，通過將某些聚合物置于干燥的臭氧流(通常為4000 ppm 1小時)中，可以賦予其生物殺滅性能。然后，當(dāng)在這些處理過的表面上沉積細(xì)菌孢子時，同一天或2-3天后，并讓它們干燥24小時，觀察到初始種群減少3到5對數(shù)(Mahfoudh等人，2010;Mahfoudh et al.， 2010)。